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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11649 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Autologer Knochentransplantatersatz (ABGS), der rhBMP6 in autologem Blutkoagulum (Osteogrow) enthält, ist eine neuartige therapeutische Lösung für die Knochenregeneration. Ziel dieser Studie ist es, das Langzeitergebnis von ABGS mit synthetischer Keramik (Osteogrow-C) im posterolateralen Wirbelsäulenfusionsmodell (PLF) von Kaninchen zu untersuchen. Osteogrow-C-Implantate wurden bilateral zwischen den Querfortsätzen der Lendenwirbelsäule von Kaninchen implantiert. Wir verglichen das Ergebnis nach der Implantation von ABGS mit Keramikpartikeln unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung (TCP und biphasische Keramik, die sowohl TCP als auch HA enthalten) und Größe (500–1700 µm und 74–420 µm). Das Ergebnis wurde nach 14 und 27 Wochen mittels Mikro-CT, Histologie und biomechanischen Analysen analysiert. Am Ende des Beobachtungszeitraums wurde bei allen Tieren eine erfolgreiche bilaterale Wirbelsäulenfusion beobachtet. Die chemische Zusammensetzung der Keramikpartikel wirkt sich über die Resorption von TCP-Keramik auf das PLF-Ergebnis aus, während HA-haltige Keramiken nur teilweise resorbiert wurden. Darüber hinaus führte die Persistenz der Keramikpartikel anschließend zu einem erhöhten Knochenvolumen bei Implantaten mit kleinen Partikeln, die einen hohen Anteil an HA enthielten. ABGS (rhBMP6/ABC) mit verschiedenen synthetischen Keramikpartikeln förderte die Wirbelsäulenfusion bei Kaninchen. Dies ist die erste Präsentation der BMP-vermittelten ektopischen Knochenbildung im Kaninchen-PLF-Modell mit radiologischen, histologischen und biomechanischen Merkmalen über einen Zeitraum von bis zu 27 Wochen.

Die posterolaterale Wirbelsäulenfusion (PLF) ist ein chirurgischer Eingriff zur Behandlung degenerativer Wirbelsäulenerkrankungen, die in der Regel durch Alterung, Tumore, Infektionen oder Arthritis verursacht werden und degenerative Bandscheibenerkrankungen, Wirbelsäuleninstabilität, Spondylolisthesis und symptomatische Skoliose umfassen1,2,3,4. Bei diesem Verfahren werden osteoinduktive Implantate und Materialien zwischen Querfortsätzen platziert, um eine Überbrückung zu erreichen und anschließend ein neues tragendes Segment in der Wirbelsäule zu bilden. Aufgrund seiner inhärenten osteoinduktiven, osteokonduktiven und osteogenen Eigenschaften gilt autologes Knochentransplantat (ABG), das aus dem Beckenkamm gewonnen wird, als Goldstandard für PLF. Darüber hinaus könnte mithilfe der Reamer-Irrigator-Aspirator-Technik (RIA) ein Autotransplantat für die Revisionschirurgie aus dem Femur gewonnen werden5,6,7. Die Verwendung von ABG bringt jedoch zwangsläufig mehrere Nachteile mit sich, die mit der Morbidität an der Entnahmestelle einhergehen, darunter Schmerzen, Wundinfektionen, Hautnarben und Deformitäten, verbunden mit einer längeren Dauer des chirurgischen Eingriffs und erhöhtem Blutverlust2,8,9,10.

Um ABG-Einschränkungen zu überwinden, werden verschiedene autologe Knochentransplantatersatzstoffe (ABGS) verwendet, die knochenmorphogenetische Proteine ​​(rhBMP2 und rhBMP7) auf verschiedenen Trägern enthalten, darunter natürliche Polymere, synthetische Polymere, Keramik und Kombinationen dieser Materialien11,12,13,14,15,16 wurden an Kaninchen3,4,17,18,19,20,21,22,23,24,25, Schafen1,26 und nichtmenschlichen Primaten in der PLF-Indikation8,21,27 getestet. Darüber hinaus wurden osteoinduktive Geräte, die rhBMP2 in Kombination mit Rinderkollagen und Keramik enthalten, in klinischen PLF-Studien an der menschlichen Wirbelsäule evaluiert, erhielten jedoch keine Marktzulassung2,9,28. Dennoch wurden hochdosierte rhBMP2-basierte Rinderkollagenvorrichtungen bei PLF-Indikationen häufig off-label eingesetzt29, was zu Immunogenität des Kollagenträgers, postoperativer Entzündung, Radikulopathie, heterotoper Ossifikation, Wirbelknochenresorption und retrograder Ejakulation führte30,31,32.

ABGS, das rhBMP6 in autologem Blutkoagulum (ABC) mit dem Namen Osteogrow enthält, ist eine neuartige therapeutische Lösung für verschiedene klinische Indikationen, einschließlich Wirbelsäulenfusionen und segmentaler Knochendefektbehandlung, die beide in präklinischen Studien untersucht wurden33,34,35,36,37,38,39,40,41 und klinische Studien42,43,44. BMP6 ist bei der Förderung der Osteoblastendifferenzierung in vitro und der Knochenregeneration in vivo aufgrund seiner Resistenz gegen Noggin wirksamer als BMP2 und BMP745,46. ABC ist ein physiologischer nativer BMP-Träger, der die Fremdkörperreaktion unterdrückt und die BMP-Bindung an Plasmaproteine ​​innerhalb des Fibrinnetzwerks fördert, um eine anhaltende In-vitro-BMP-Freisetzung zu ermöglichen33,34,36.

Wir haben die potenzielle Verwendung dieses neuartigen ABGS in präklinischen PLF-Studien getestet. Um die biomechanischen Eigenschaften der Osteogrow-Implantate zu verbessern, haben wir den Implantaten eine kompressionsresistente Matrix (CRM) hinzugefügt34. Zunächst untersuchten wir die Verwendung von ABGS mit Allotransplantat (Osteogrow-A) in Kaninchen- und Schaf-PLF-Modellen34,35, und nach dem erfolgreichen Ergebnis wurde eine ähnliche ABGS-Formulierung bei Patienten getestet, die sich einer PLF aufgrund einer degenerativen Bandscheibenerkrankung unterzogen (EudraCT-Nummer 2017- 000860-14). Allotransplantatknochen weist jedoch Einschränkungen auf, einschließlich regulatorischer Probleme, Immunogenität und einem geringen, aber immer noch bestehenden Risiko einer Virusübertragung4,47. Um eine sichere und effiziente Alternative zum Allotransplantat zu finden, haben wir daher gezeigt, dass ABGS mit synthetischen Calciumphosphat (CaP)-Keramikpartikeln (Osteogrow-C) sieben Wochen nach der Operation eine erfolgreiche PLF bei Kaninchen förderte37. Zu den CaP-Keramiken gehören Tricalciumphosphat (TCP; Ca3PO4) und Hydroxyapatit (HA; Ca10(PO4)6(OH)2). Der Hauptunterschied zwischen ihnen ist die Resorbierbarkeit, da TCP deutlich schneller resorbiert wird als HA. Darüber hinaus könnten TCP und HA in verschiedenen Verhältnissen zu zweiphasigem Calciumphosphat (BCP) kombiniert werden, um die Resorbierbarkeit der Keramik anzupassen48,49. Aufgrund eines einzigen Zeitpunkts und eines kurzen Beobachtungszeitraums konnten wir in unserer vorherigen Arbeit37 die Langlebigkeit neu gebildeten Knochens und den Einfluss der chemischen Zusammensetzung von Keramik (TCP vs. BCP) auf das Ergebnis der Wirbelsäulenfusion über einen längeren Zeitraum nicht bestimmen Zeit.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir den Einfluss der chemischen Zusammensetzung, der Größe der Keramikpartikel und der BMP6-Dosierung auf das Ergebnis der PLF-Wirbelsäulenfusion bei Kaninchen. Wir haben auch den zeitlichen Verlauf der ektopischen Knocheninduktion zwischen den Querfortsätzen beschrieben und das Knochenvolumen sowie die biomechanischen Eigenschaften des neu induzierten ektopischen Knochens bestimmt.

Alle getesteten ABGS-Implantate mit Keramikpartikeln induzierten neuen Knochen und eine bilaterale Brücke zwischen benachbarten Querfortsätzen, wie am Ende der Wochen 14 und 27 durch Mikro-CT-3D-Rekonstruktionen und Beobachtung grober Anatomieproben beobachtet wurde (Abb. 1). Bei allen Proben wurde durch palpatorische Tests eine segmentale Immobilität beobachtet (16/16 im ersten und 24/24 im zweiten Experiment). Darüber hinaus wurde die Integration des neuen Knochens mit Querfortsätzen in Mikro-CT-Schnitten bestätigt (Abb. 2).

Bruttoanatomie und Mikro-CT-3D-Rekonstruktion von neu induziertem ektopischem Knochen, der mit Querfortsätzen verschmolzen ist. ABGS-Implantate mit TCP- (links) und BCP-Keramik (rechts) induzierten ektopen Knochen, der mit benachbarten Querfortsätzen verschmolz, wie an mazerierten Proben 14 Wochen nach der Implantation (1. Reihe) und an der microCT-3D-Rekonstruktion 14 Wochen (2. Reihe) und 27 Wochen ( 3. Reihe) nach der Operation. Bei Tieren mit einer Nachbeobachtungszeit von 14 Wochen wurde die Wirbelsäulenfusion mit ABGS (rhBMP6/ABC) und 500–1700 µm TCP- oder BCP-Keramik mit einer rhBMP6-Dosis von 125 (linke Seite der Wirbelsäule) oder 250 µg (rechts) erreicht Seite der Wirbelsäule) (n = 4 pro Gruppe). Bei Tieren wurde die Wirbelsäulenfusion nach 27 Wochen mit ABGS erreicht, das 125 µg rhBMP6 in ABC mit TCP- oder BCP-Keramik in zwei verschiedenen Partikelgrößen enthielt: 500–1700 µm (linke Seite jedes Tieres) oder 74–420 µm (rechte Seite jedes Tieres). jedes Tier) (n = 6 pro Gruppe).

MicroCT-Schnitte durch neu induzierten ektopischen Knochen, der mit Querfortsätzen verschmolzen ist. Verschiedene ABGS-Formulierungen mit synthetischer Keramik induzierten erfolgreich die Fusion zwischen benachbarten Querfortsätzen, wie bei acht Kaninchen gezeigt wurde. (A) Wirbelsäulenfusion nach 14 Wochen, induziert durch ABGS mit 500–1700 µm TCP- oder BCP-Keramikpartikeln (TCP/HA 80/20) mit der rhBMP6-Dosis von 125 µg (1, 3, 5, 7) oder 250 µg (2). , 4, 6, 8) (n = 4 pro Gruppe). (B) Wirbelsäulenfusion nach 27 Wochen, induziert durch ABGS, das TCP- oder BCP-Partikel (TCP/HA 40/60) in zwei verschiedenen Größen enthält; 500–1700 µm (1, 3, 5, 7) und 74–420 µm (2, 4, 6, 8) mit 125 µg rhBMP6 (n = 6 pro Gruppe). Maßstabsbalken werden in der unteren linken Ecke angezeigt.

Nach 14 Wochen war die Menge an neugebildetem Knochen bei allen Tieren groß (Abb. 3, erste Reihe). Die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen waren weder hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung der Keramikpartikel (TCP vs. BCP (TCP/HA 80/20)) noch der rhBMP6-Dosis (125 µg vs. 250 µg) signifikant (Abb. 3A, erste Reihe). . Nach 27 Wochen war das Knochenvolumen bei allen Proben erhalten. Allerdings war das Knochenvolumen bei Implantaten, die kleine BCP-Partikel (TCP/HA 40/60) enthielten, im Vergleich zu anderen Versuchsgruppen deutlich höher (Abb. 3B, erste Reihe).

MicroCT-Analysen von neu induziertem ektopischem Knochen, der mit Querfortsätzen verschmolzen ist. (A) Knochenvolumen (1. Reihe) und CRM-Volumen (2. Reihe) in Proben, die TCP- und BCP-Keramikpartikel enthalten, 14 Wochen nach der ABGS-Implantation. Balken stellen Implantate mit 125 µg (hellblau) und 250 µg (dunkelblau) rhBMP6 dar (n = 4 pro Gruppe). (B) Knochenvolumen (1. Reihe) und CRM-Volumen (2. Reihe) in Proben mit 74–420 µm (hellblau) und 500–1700 µm (dunkelblau) TCP- oder BCP-Keramikpartikeln 27 Wochen nach der ABGS-Implantation (n = 6). pro Gruppe). (C) Zusammengefasste Werte für Knochenvolumen (1. Reihe) und CRM-Volumen (2. Reihe) in Proben, die TCP oder BCP in Partikeln mittlerer Größe (500 bis 1700 µm) enthalten, nach 14 und 27 Wochen im Vergleich zu unserer zuvor veröffentlichten Arbeit mit a Nachbeobachtungszeit von 7 Wochen (geändert von 37). Alle P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen und sind mit Sternchen gekennzeichnet: *(P ≤ 0,05), **(P ≤ 0,01), ***(P ≤ 0,001).

In der 14. Woche nach der Operation war das CRM-Volumen in den Gruppen, die TCP enthielten, signifikant verringert als in den Proben mit BCP (TCP/HA 80/20) (Abb. 3A, zweite Reihe). In Woche 27 waren die Unterschiede im CRM-Volumen, das Partikel unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung (TCP und BCP (TCP/HA 40/60)) enthielt, aufgrund einer längeren Nachbeobachtungszeit und eines erhöhten HA-Anteils in zweiphasigen Keramikpartikeln ausgeprägter (Abb . 3B, zweite Reihe).

Um den Zeitplan der ektopischen Knochenbildung an der ektopischen Stelle im Kaninchen-PLF-Modell zu ermitteln, haben wir die Ergebnisse dieser Studie auch mit Daten aus der vorherigen Studie verglichen37 (Abb. 3C). Da es zu den beobachteten Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede im Knochenvolumen zwischen verschiedenen Versuchsgruppen gab, haben wir alle Proben mit ähnlicher Partikelgröße (500–1700 µm) und derselben rhBMP6-Dosis (125 µg) vom gleichen Zeitpunkt zusammengefasst. Das CRM-Volumen wurde getrennt für TCP- und BCP-Keramik (500–1700 µm) dargestellt. Diese Analysen ergaben, dass die Knochenmenge im Verlauf der Nachbeobachtungszeit von 7, 14 und 27 Wochen zunahm (Abb. 3C, erste Reihe), während das CRM-Volumen mit der Zeit abnahm, und dies war besonders ausgeprägt bei Partikeln, die nur TCP enthielten ( Abb. 3C, zweite Reihe).

Bei allen Proben, die 14 und 27 Wochen nach der ABGS-Implantation entnommen wurden, konnte eine erfolgreiche Integration des neu gebildeten Knochens mit angrenzenden Querfortsätzen beobachtet werden (Abb. 4).

Nicht demineralisierte histologische Schnitte von neu gebildetem Knochen, der in der 14. und 27. Woche nach der ABGS-Implantation mit angrenzenden Querfortsätzen verschmolzen ist. Durch ABGS induzierter neuer Knochen, der mit angrenzenden Querfortsätzen verschmolzen ist. Kortikaler Knochen bildete eine Kontinuität mit Querfortsätzen (gelbe Pfeile). (A) In Woche 14 schien TCP (1–2) stärker resorbiert zu sein als BCP (TCP/HA 80/20) (3–4). (B) 27 Wochen nach der Implantation waren die Unterschiede zwischen TCP und BCP (TCP/HA 40/60) deutlich: TCP-Partikel wurden nämlich fast vollständig resorbiert (1, 2, 5, 6), während BCP-Partikel leicht resorbiert wurden (3, 4, 7, 8). Histologische Schnitte wurden mit Goldner- oder Von-Kossa-Färbung gefärbt. In der unteren linken Ecke werden Maßstabsbalken angezeigt.

Histologische Analysen der in Woche 14 entnommenen Proben ergaben, dass der neue Knochen ausgeprägten kortikalen Knochen enthielt, der in Kontinuität mit dem kortikalen Knochen der Querfortsätze stand (Abb. 4A). Darüber hinaus war neuer Knochen auf den Oberflächen und zwischen den Keramikpartikeln vorhanden (Abb. 4A). Knochenbälkchen waren von Knochenmark umgeben, das eine große Menge sowohl an Adipozyten als auch an hämatopoetischen Zellen enthielt. Wichtig ist, dass auch die Keramikpartikel vollständig in die Querfortsätze integriert waren. Bemerkenswerterweise gab es unabhängig von der BMP-Dosis keinen signifikanten Unterschied im Knochenvolumen und CRM-Volumen.

Bei Proben aus der 27. Woche gab es einen auffälligen Unterschied zwischen den Versuchsgruppen mit TCP- und BCP-Partikeln, die TCP und HA im Verhältnis 40/60 enthielten (Abb. 5A, 6A, B). TCP-Partikel wurden nahezu vollständig resorbiert, während BCP-Partikel über einen längeren Zeitraum hinweg persistierten. Proben mit TCP-Keramik enthielten Knochenbälkchen, reichlich Knochenmark und Reste der TCP-Partikel. Wichtig ist, dass Partikel mit einer Größe von 500–1700 µm im Vergleich zu Partikeln mit einer Größe von 74–420 µm weniger resorbiert wurden. Im Gegensatz dazu enthielten Proben mit BCP-Partikeln hartnäckige Keramikpartikel und Knochen auf den Oberflächen und zwischen den Partikeln. Ein wichtiges histologisches Merkmal aller Proben war eine kortikale Knochenkontinuität mit Querfortsätzen (Abb. 4B). Ähnlich wie in Woche 14 enthielt das Knochenmark sowohl hämatopoetische Zellen als auch Adipozyten.

Histologische Analyse des neu gebildeten Knochens, der mit benachbarten Querfortsätzen verschmolzen ist, in der 7., 14. und 27. Woche nach der Implantation von ABGS mit 500–1700 µm großen Partikeln. (A) Neu gebildeter Knochen wird durch ABGS an den Oberflächen und zwischen synthetischen Keramikpartikeln (A1–2) induziert. Kleine Bereiche mit anhaltender endochondraler Ossifikation waren in wenigen Proben vorhanden (A3) (unveröffentlichte Daten von Stokovic N et al., Bone37). 14 Wochen nach der Implantation befand sich zwischen den Keramikpartikeln neu gebildeter Knochen, umgeben von reichlich Knochenmark (A4–8). TCP-Partikel (A4–5) wurden im Vergleich zu BCP-Partikeln (TCP/HA 80/20) (A7–8) stärker resorbiert. Knochenmark enthielt sowohl hämatopoetische Zellen als auch Adipozyten (A6). An den Grenzen war kortikaler Knochen vorhanden (A9). Die Anzahl der analysierten Proben betrug 4 pro Gruppe. 27 Wochen nach der Operation sind die TCP-Partikel deutlich resorbiert und das wichtigste Strukturmerkmal ist ausgeprägter kortikaler Knochen. Im zentralen Teil des Implantats (A10–12) waren Reste der TCP-Keramikpartikel sichtbar, die von reichlich Knochenmark umgeben waren. Im Gegensatz dazu waren BCP-Partikel (TCP/HA 40/60) nicht resorbiert und Knochen war auf den Oberflächen und zwischen den Partikeln vorhanden (A13–14). Knochenmark enthielt sowohl hämatopoetische Zellen als auch Adipozyten (A15). Die Schnitte wurden mit Goldner- (A1–2, A4–8, A13–14) oder Von-Kossa-Färbung (A3, A9–12, A15) gefärbt. Gelbe Pfeile deuten auf neu gebildeten Knochen hin, Sternchen auf Keramikpartikel, orangefarbene Pfeile auf endochondrale Ossifikation und violette Pfeile auf Blutgefäße. Die Anzahl der analysierten Proben betrug 6 pro Gruppe. In der rechten Ecke jedes Bildes werden Maßstabsbalken angezeigt. Anteile (%) von Knochen, CRM und Knochenmark in Gruppen mit 500–1700 µm großen TCP- oder BCP-Partikeln in Woche 14 (B) und 27 (C). Kortikale Dicke in den Wochen 14 (D) und 27 (E) von neuem Knochen, der durch ABGS mit 500–1700 µm großen TCP- und BCP-Partikeln induziert wurde. Die Ergebnisse der 14. Woche werden unabhängig von der angewendeten rhBMP6-Dosis (B, D) präsentiert. (F) Zusammengefasste Werte (TCP, 500–1700 µm) von Knochen, CRM und Knochenmark im zentralen Teil des neu gebildeten Knochens in der 7. (modifizierte oder unveröffentlichte Daten aus37), 14. und 27. Woche. (G) Kortikale Dicke der Implantate bis zur 7., 14. und 27. Woche; Die Ergebnisse werden von allen Gruppen ab einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt. Als Kontrolle diente die Dicke der Querfortsätze (T). (H) MicroCT bestimmte Anteile (%) des kortikalen und trabekulären Knochens in den Versuchsgruppen in Woche 27. Alle P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen und sind mit Sternchen markiert: *(P ≤ 0,05), **(P ≤ 0,01), ***(P ≤ 0,001).

Histologische Analyse des neu gebildeten Knochens, der mit angrenzenden Querfortsätzen verschmolzen ist, in der 27. Woche nach der Implantation von ABGS mit Partikeln von 74–420 µm. Der Unterschied in den histologischen Merkmalen von Proben mit TCP- (A) und BCP-Partikeln (TCP/HA 40/60) (B) 27 Wochen nach der Implantation war signifikant: In Proben mit TCP-Partikeln (A1–6) war die Keramik fast vollständig resorbiert und Die wichtigsten histologischen Merkmale waren Knochenbälkchen mit reichlich Knochenmark. Es wurden lediglich Reste von Keramikpartikeln beobachtet. Im Gegensatz dazu waren in Proben mit BCP-Keramik (B1–6) die Keramikpartikel nicht resorbiert und es gab ein dichtes Knochennetzwerk zwischen und auf den Oberflächen der Keramikpartikel. Die Schnitte wurden mit Goldner- (A3–4, B2–3, B6) oder Von-Kossa-Färbung (A1–2, A5–6, B1, B4–5) gefärbt. Gelbe Pfeile deuten auf neu gebildeten Knochen hin, Sternchen auf Keramikpartikel und violette Pfeile auf Blutgefäße. Die Anzahl der analysierten Proben betrug 6 pro Gruppe. In der rechten Ecke jedes Bildes werden Maßstabsbalken angezeigt. In der rechten Ecke jedes Bildes werden Maßstabsbalken angezeigt. (C) Anteile (%) von Knochen, CRM und Knochenmark. (D) Kortikale Dicke bei Gruppen mit 74–420 µm TCP- und BCP-Keramik in Woche 27 nach der Implantation. (E) MicroCT bestimmte Anteile (%) des kortikalen und trabekulären Knochens in den Versuchsgruppen in Woche 27. Alle P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen und sind mit Sternchen markiert: *(P ≤ 0,05), **(P ≤ 0,01), ***(P ≤ 0,001).

Histomorphometrische Analysen wurden durchgeführt, um den Anteil von Knochen, Knochenmark und CRM im zentralen Teil des mit Querfortsätzen verwachsenen Knochens sowie die Dicke des kortikalen Knochens zu bestimmen.

In Woche 14 waren die Unterschiede in den gemessenen Parametern zwischen den Versuchsgruppen nicht signifikant (Abb. 5B). In Woche 27 war der Anteil an CRM und Knochen jedoch höher, während der Anteil an Knochenmark bei Proben, die BCP enthielten, niedriger war als bei Proben mit TCP-Keramik (Abb. 5C, 6C). Die kortikale Knochendicke war in Woche 27 bei Proben mit 500–1700 µm TCP-Keramik leicht erhöht (Abb. 5E, 6D), während die Dicke in den Versuchsgruppen in Woche 14 vergleichbar war (Abb. 5D). Darüber hinaus ergaben Mikro-CT-Analysen, dass kortikaler Knochen in Woche 27 den Großteil des gesamten Knochenvolumens ausmachte (Abb. 5H, 6E).

Die erhaltenen Ergebnisse wurden retrospektiv mit den Ergebnissen unserer vorherigen Arbeit in Woche 7 verglichen (Abb. 5F, G). Histomorphometrische Analysen ergaben, dass die Menge an Knochen, Knochenmark und CRM in den Wochen 14 und 27 vergleichbar war. In Woche 27 waren die Menge an Knochen und CRM jedoch im Vergleich zur Woche signifikant verringert, während die Menge an Knochenmark signifikant zunahm 7 (Abb. 5F). Im Gegenteil, die Dicke des kortikalen Knochens war in Woche 27 und 14 im Vergleich zu Woche 7 deutlich höher (Abb. 5G).

Die in den Wochen 14 und 27 ermittelten biomechanischen Eigenschaften des neu gebildeten Knochens, der in benachbarte Querfortsätze integriert war, waren denen nativer Querfortsätze überlegen.

Proben aus der 14. Woche wurden unabhängig von der rhBMP6-Dosis auf der Grundlage der chemischen Zusammensetzung des CRM gruppiert (Abb. 7, erste Spalte), und es gab keine Unterschiede in den beobachteten biomechanischen Parametern (Kraft, Elastizität und Arbeit) zwischen Proben mit TCP und BCP ( TCP/HA 80/20).

Biomechanische Eigenschaften von neu gebildetem Knochen, der mit benachbarten Querfortsätzen verschmolzen ist. (A) Biomechanische Eigenschaften (Kraft, Elastizität und Brucharbeit) von Proben, die TCP- oder BCP-Keramikpartikel (500–1700 µm) enthalten, in Woche 14 nach der Implantation. Die Proben wurden unabhängig von der rhBMP6-Dosis nach der chemischen Zusammensetzung der Partikel gruppiert. Als Kontrollgruppe dienten Querprozesse (T). (B) Biomechanische Eigenschaften von Proben, die TCP- oder BCP-Keramikpartikel enthalten, 27 Wochen nach der ABGS-Implantation. Die Partikelgröße betrug entweder 500–1700 µm (mittel, M) oder 74–420 µm (klein, S). Als Kontrollgruppe dienten Querprozesse (T). Die Anzahl der analysierten Proben betrug 3–4 pro Gruppe. (C) Zusammengefasste Werte für Kraft, Elastizität und Brucharbeitszeit nach 14 und 27 Wochen und unser vorheriges Ergebnis 7 Wochen nach der Implantation (modifiziert von 37). T Querfortsätze. Alle P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen und sind mit Sternchen gekennzeichnet: *(P ≤ 0,05), **(P ≤ 0,01), ***(P ≤ 0,001).

Nach 27 Wochen verglichen wir die biomechanischen Parameter von Proben, die mittlere (500–1700 µm) und kleine (74–420 µm) Partikel mit zwei unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen (TCP und BCP (TCP/HA 40/60)) enthielten (Abb. 7, zweite Spalte). Proben mit mittelgroßen BCP-Partikeln erforderten deutlich mehr Kraft und Arbeit, um die Fusion aufzubrechen, als Proben mit kleinen TCP-Partikeln.

Schließlich wurden die in dieser Studie in den Wochen 14 und 27 ermittelten biomechanischen Eigenschaften des Knochens mit den Ergebnissen unserer vorherigen Studie verglichen, in der sieben Wochen nach der Implantation biomechanische Tests durchgeführt wurden37. Der Kraft- und Arbeitsaufwand für den Knochenbruch war in der 14. und 27. Woche deutlich höher als in der 7. Woche nach der Implantation (Abb. 7, dritte Spalte). Andererseits war die Elastizität des neuen ektopischen Knochens in Woche 7 höher als in Woche 14 und 27.

Die Suche nach einem optimalen autologen Knochentransplantatersatz für die posterolaterale Wirbelsäulenfusion ist aufgrund des relativ großen Abstands zwischen den Querfortsätzen, der mit neu induziertem ektopischem Knochen überbrückt werden sollte, des Vorhandenseins von Druckkräften in der Umgebung und der Nähe kritischer Bereiche eine anspruchsvolle Aufgabe im Knochengewebe-Engineering anatomische Strukturen. Knochenmorphogenetische Proteine ​​sind wirksame osteoinduktive Moleküle und eine Voraussetzung für die ektopische Knochenbildung50,51,52. Sie benötigen jedoch einen Träger, der das Protein an der Behandlungsstelle hält11,12,13,14,15,16,53. Um dieses Problem anzugehen, wurden mehrere BMP-Träger-/Abgabesysteme vorgeschlagen und im PLF-Modell getestet: Kollagen4,19,22, synthetische Polymere25,54, Calciumphosphat (CaP)-Keramik3,18,21,22,24,26,27 ,55 und Kombination aus Kollagen und CaP-Keramik1,8,18,21 oder synthetischen Polymeren und CaP-Keramik23. Bisher wurde jedoch keines dieser Geräte klinisch getestet und für den klinischen Einsatz zugelassen.

ABGS, bestehend aus rhBMP6 im autologen Blutkoagulum als physiologischem BMP-Träger und synthetischer Keramik als kompressionsbeständiger Matrix, ist ein neuartiges osteoinduktives Gerät zur Knochenregeneration33,34,35,37. In unseren früheren Studien am subkutanen Rattenmodell haben wir mehrere ungelöste Probleme in Bezug auf die ABGS-Formulierung angesprochen, darunter die optimale Dosis und Methode der rhBMP6-Anwendung sowie die optimale Kombination aus Größe und chemischer Zusammensetzung von Keramikpartikeln38,41,56. Darüber hinaus haben wir in unserer ersten PLF-Studie mit Keramik als CRM gezeigt, dass ABGS, das synthetische Keramik namens Osteogrow-C enthält, die Wirbelsäulenversteifung fördert, und bestätigten die Erkenntnisse aus Rattenstudien, dass es zwei gleichermaßen effiziente Methoden der BMP6-Anwendung gibt: rhBMP6 könnte auf Keramik lyophilisiert werden Partikel oder direkt dem Eigenblut zugesetzt37,56. Aufgrund der relativ kurzen Nachbeobachtungszeit (7 Wochen) konnten wir jedoch den Einfluss der chemischen Zusammensetzung der Partikel auf die CRM-Resorptionsrate nicht beobachten. In der vorliegenden Studie haben wir zum ersten Mal untersucht, wie sich sowohl die chemische Zusammensetzung als auch die Partikelgröße von Keramik über einen längeren Zeitraum auf das Ergebnis im Kaninchen-PLF-Modell auswirken.

Um zunächst den Einfluss der chemischen Zusammensetzung auf das PLF-Ergebnis zu bestimmen, führten wir ein Experiment mit einer verlängerten Nachbeobachtungszeit von 14 Wochen durch. In diesem Experiment war die Resorptionsrate von TCP-Partikeln deutlich höher als die von BCP-Partikeln. Allerdings waren die Knochenmenge und die biomechanischen Eigenschaften des neuen ektopischen Knochens bei Proben mit TCP- und BCP-Partikeln (TCP/HA 80/20) vergleichbar. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass 125 µg pro Implantat ausreichend sind und dass es mit einer zusätzlichen Menge an rhBMP6 zu keiner weiteren Erhöhung des Knochenvolumens kommt, was im Einklang mit früheren Studien steht, in denen rhBMP2 auf Kollagen oder Keramik als Träger verwendet wurde3,4,24. Zweitens führten wir ein weiteres Experiment durch, bei dem wir den Nachbeobachtungszeitraum auf 27 Wochen verlängerten und den Anteil von HA in BCP (zu TCP) erhöhten, um den Einfluss der chemischen Zusammensetzung von CRM auf das Ergebnis und die Langlebigkeit von Knochen im PLF-Modell weiter zu untersuchen /HA 40/60). Darüber hinaus haben wir in diesem Experiment das PLF-Ergebnis zwischen ABGS-Formulierungen mit mittleren und kleinen Partikeln verglichen. Das wichtigste Ergebnis war, dass unterschiedliche chemische Zusammensetzungen von Partikeln, unabhängig von ihrer Partikelgröße, nach einem längeren Zeitraum zu großen Unterschieden in der CRM-Menge führen können. Darüber hinaus war das Volumen des neu gebildeten Knochens bei Implantaten erhöht, die kleine zweiphasige Keramikpartikel enthielten, die mit der Zeit nicht resorbiert wurden. Wir glauben, dass die chemische Zusammensetzung von Keramik je nach klinischer Indikation bevorzugt sein könnte. Hoch resorbierbares TCP könnte beispielsweise für Indikationen verwendet werden, bei denen Osteogrow C zur Wiederherstellung von Knochendefekten verwendet wird und bei denen neu gebildeter Knochen natürlichen Knochen nachahmen soll. Andererseits könnten biphasische Keramiken bei Indikationen wie PLF bevorzugt werden, bei denen nicht resorbierte Keramikpartikel und ein erhöhtes Knochenvolumen die biomechanischen Eigenschaften der Fusionsmasse über einen langen Zeitraum verbessern könnten. Es muss jedoch unbedingt betont werden, dass alle in dieser Studie getesteten ABGS-Formulierungen zu einer erfolgreichen Wirbelsäulenfusion mit signifikanten biomechanischen Eigenschaften führten. Dies war das erste Mal, dass Keramiken, die sich sowohl in der Größe als auch in der chemischen Zusammensetzung unterschieden, im PLF-Tiermodell verglichen wurden, da in den meisten früheren Studien nur eine Keramikart3,20,23,24,26 mit unterschiedlichen BMP-Dosen bewertet oder mit dieser verglichen wurde Autotransplantat. Nur wenige PLF-Studien verglichen Keramiken mit unterschiedlichen TCP/HA-Verhältnissen; Allerdings konnten bei einer kurzen Nachbeobachtungszeit von nur 5 Wochen keine Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet werden21.

Der andere große Mangel früher veröffentlichter PLF-Studien war die relativ kurze Nachbeobachtungszeit, die typischerweise kürzer als acht Wochen war3,17,18,20,21,22,23,24,37,57,58,59. Obwohl die Auswertung zu diesen Zeitpunkten ausreichte, um das Ergebnis der Wirbelsäulenfusion zu bestimmen, wurde die Langlebigkeit des ektopischen Knochens nicht verfolgt. Die Knochenlebensdauer in PLF-Studien an Kaninchen wurde nur in wenigen Studien mit einer Nachbeobachtungszeit von 14 Wochen oder länger bewertet4,34. Diese Studien hatten jedoch nur einen Beobachtungszeitpunkt, was es nicht ermöglichte, einen zeitlichen Verlauf der Knochenbildung und -umgestaltung im Kaninchen-PLF-Modell zu ermitteln, da sich die Nachbeobachtung nur auf die Röntgenuntersuchung des Ergebnisses beschränkte. Der Abschluss der oben genannten Reihe von PLF-Experimenten ermöglichte es uns zum ersten Mal, den Zeitverlauf der ektopischen Knochenbildung im Kaninchen-PLF-Modell zu bestimmen und zu beschreiben, wie sich radiologische, histologische und biomechanische Befunde im Laufe der Zeit verändern. MicroCT-Analysen ergaben, dass die Gesamtknochenmenge von Woche sieben bis Woche 27 zunahm. Dies steht im Einklang mit einer zuvor veröffentlichten Studie, in der das Knochenvolumen anhand einer Reihe von Röntgenbildern über den Nachbeobachtungszeitraum von 24 Wochen bestimmt wurde4. Der zeitliche Anstieg des Knochenvolumens könnte auf eine Zunahme der Kortikalisdicke und eine erhöhte Mineralisierung des Knochens über den Zeitraum von 27 Wochen zurückzuführen sein. Darüber hinaus ergaben histologische Analysen, dass sich die Struktur des neu gebildeten Knochens deutlich veränderte: In Woche 7 gab es mehr Knochen zwischen den Partikeln mit einem diskreten kortikalen Knochen, während zu einem späteren Zeitpunkt (Woche 14 und 27) der kortikale Knochen stärker ausgeprägt war mit einem verringerte Knochenmenge zwischen den Partikeln. Diese mikroCT- und histologischen Befunde korrelierten mit den verbesserten biomechanischen Eigenschaften des Knochens in Woche 14 und 27 im Vergleich zu Woche 7.

ABGS, das rhBMP6 in ABC mit verschiedenen Keramikpartikeln enthielt, förderte die bilaterale Wirbelsäulenfusion im Kaninchen-PLF-Modell. Eine erfolgreiche Wirbelsäulenfusion und Integration des neu gebildeten Knochens mit angrenzenden Querfortsätzen wurde bei allen implantierten Proben mittels Mikro-CT, histologischen Schnitten und biomechanischen Tests beobachtet. Im Langzeit-Follow-up von 27 Wochen wurde der signifikanteste Unterschied zwischen den Versuchsgruppen bei Implantaten mit einer unterschiedlichen chemischen Keramikzusammensetzung beobachtet, da TCP resorbiert wurde, während HA-haltige Keramiken nur teilweise resorbiert wurden. Wichtig ist, dass die Persistenz von Keramikpartikeln zu einem erhöhten Knochenvolumen bei Implantaten führte, die kleine, zweiphasige Keramikpartikel enthielten, die mit der Zeit nicht resorbiert wurden.

Zunächst verglichen wir das Ergebnis der PLF 14 Wochen nach der Implantation von ABGS (rhBMP6/ABC), das synthetische Keramikpartikel (500–1700 µm) in zwei unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen (TCP und BCP mit TCP/HA im Verhältnis 80/20) enthielt, und zwei verschiedene rhBMP6-Dosen (125 µg und 250 µg/pro Implantat). Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen haben wir ein weiteres Experiment entworfen, in dem wir den Nachbeobachtungszeitraum auf 27 Wochen verlängerten und den Anteil von HA in BCP (auf TCP/HA 40/60) erhöhten, um einen deutlicheren Unterschied zwischen Restkeramik zu erzielen und zu bestimmen ob das bevorzugte Ergebnis eine rechtzeitige Resorption oder Konservierung der Keramik ist. Darüber hinaus verglichen wir in diesem Experiment zwei verschiedene Partikelgrößen (74–420 µm und 500–1700 µm), während die rhBMP6-Dosis gemäß den Ergebnissen des ersten Experiments 125 µg/pro Implantat betrug. Um die biologische Variabilität zu verringern, wurden auf der linken und rechten Seite unterschiedliche Osteogrow-C-Formulierungen implantiert. Kurz gesagt, im ersten Experiment wurden jedem Tier Osteogrow C-Implantate implantiert, die entweder TCP und BCP enthielten, wobei die applizierte rhBMP6-Dosis auf der linken (125 µg) und rechten (250 µg) Seite unterschiedlich war. In den zweiten Experimenten erhielt jedes Tier Osteogrow C-Implantate entweder mit TCP oder BCP, wobei die Größe der Keramikpartikel auf den verschiedenen Seiten unterschiedlich war (500–1700 µm-Partikel wurden auf der linken Seite implantiert und 74–420 µm-Partikel wurden auf der rechten Seite implantiert). Die Anzahl der Implantate betrug im ersten Experiment vier pro Gruppe und im zweiten Experiment sechs pro Gruppe. Die Stichprobengröße wurde auf Grundlage früherer Studien in diesem Modell und Empfehlungen zum rationellen Einsatz von Versuchstieren einschließlich des 3R-Prinzips (Replacement, Reduction, Refinement) ermittelt. Das experimentelle Design der Studie ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse wurden retrospektiv mit unseren zuvor veröffentlichten Ergebnissen bei Kaninchen-PLF 7 Wochen nach der Operation unter Verwendung modifizierter und unveröffentlichter Ergebnisse verglichen37. In der veröffentlichten Studie verwendeten wir Osteogrow C-Implantate mit 125 µg rhBMP6 in ABC mit 500–1700 µm großen TCP- oder BCP-Keramikpartikeln (TCP/HA im Verhältnis 80/20). Daher waren die Ergebnisse dieses Experiments mit den in der Studie bewerteten analogen Formulierungen vergleichbar aktuelle Studie.

Die Experimente wurden an 20 weißen Neuseeland-Kaninchen (lat. Oryctolagus cuniculus, 20 Wochen alt, männlich, Körpergewicht 3–5 kg) durchgeführt, die in Standard-Kaninchenkäfigen mit Umgebungsanreicherung unter herkömmlichen Laborbedingungen (Temperatur 18–24 °C) gehalten wurden , relative Luftfeuchtigkeit 50–70 %, Geräuschpegel 60 dB und Beleuchtung 12 h/Tag) in der registrierten Tierhaltung des Labors für mineralisierte Gewebe (HR-POK-001). Standardnahrung und Süßwasser wurden nach Belieben bereitgestellt. Die Genehmigung für die Studien wurde von der Direktion für Veterinär- und Lebensmittelsicherheit des Landwirtschaftsministeriums der Republik Kroatien erteilt. Die ethischen Grundsätze der Studie gewährleisteten die Einhaltung der europäischen Richtlinie 2010/63/EU, des Gesetzes zur Änderung des Tierschutzgesetzes (Amtsblatt 37/13), des Tierschutzgesetzes (Amtsblatt 102/17) und der Tierschutzverordnung Verwendung für wissenschaftliche Zwecke (Amtsblatt 55/13), ARRIVE-Richtlinien, FELASA-Empfehlungen und Empfehlungen der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zagreb und der Nationalen Ethikkommission (EP 187/2018).

Autologes Blut (2,5 ml pro Implantat) wurde aus der Randohrvene des Kaninchens in Röhrchen ohne gerinnungshemmende Substanz gesammelt, die rhBMP6 enthielten (125 oder 250 µg je nach Versuchsaufbau), wie zuvor beschrieben34,37. Blut wurde in Spritzen (5 ml) mit Keramikpartikeln (0,5 g von 500–1700 μm-Partikeln oder 0,8 g von 74–420 μm-Partikeln) aufgezogen, vorsichtig gemischt und gedreht, bis das Blut koagulierte, um eine gleichmäßige Partikelverteilung im Implantat zu erreichen (Abb . 8). Die Menge der 74–420 µm-Partikel war höher als die der 500–1700 µm-Partikel, um das gleiche Volumen an Transplantatmaterial (1 cm³) und anschließend eine gleichmäßige Partikelverteilung im Implantat zu erreichen. Die endgültige rhBMP6-Konzentration in den Implantaten betrug 50 bzw. 100 µg/ml für Implantate, die 125 bzw. 250 µg rhBMP6 enthielten. Nach der Blutgerinnung wurden die Implantate bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Stunden nach der Vorbereitung gemäß der in präklinischen Osteogrow-Studien ermittelten rhBMP6/ABC-Stabilität implantiert.

Vorbereitung und Implantation von ABGS (Osteogrow-C). (1) rhBMP6 wurde zur Injektion in Wasser gelöst und dem aus der marginalen Kaninchenohrvene entnommenen Blut zugesetzt. Blut, das rhBMP6 enthielt, wurde mit Keramikpartikeln vermischt, in eine Spritze (2) gegeben und bei Raumtemperatur 60–90 Minuten lang geronnen. Das ABGS-Implantat wurde von der Spritzenwand gelöst, in eine Petrischale gelegt und in die seitliche Rinne zwischen den Querfortsätzen L5-L6 implantiert (3). Am Ende der Nachbeobachtungszeit überbrückte der durch ABGS induzierte neugebildete Knochen die Lücke zwischen den Querfortsätzen (orangefarbener Pfeil) (4).

Zwanzig weiße Neuseeland-Kaninchen wurden wie beschrieben einer bilateralen posterolateralen Lumbalfusion (L5-L6) unterzogen34,37. Den Tieren wurde eine Prämedikation mit einer Mischung aus Xylazin (Xylapan®, Vetoquinol, Schweiz) 5 mg/kg und Ketamin (Ketaminol® Vetoquinol, Schweiz) 35 mg/kg intramuskulär verabreicht. Die Vollnarkose wurde mit einer Mischung aus Isofluran (1–1,5 %) und über eine Maske zugeführtem Sauerstoff aufrechterhalten. Es wurde ein Hautschnitt in der dorsalen Mittellinie vorgenommen, der von L4 bis L7 reichte, gefolgt von einem paramedianen Faszienschnitt. Die paravertebralen Muskeln wurden seitlich zurückgezogen, was die Freilegung der Querfortsätze L5–L6 erleichterte. Freiliegende Querfortsätze wurden dann mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer dekortiziert und Osteogrow-C-Implantate wurden beidseitig in der Rinne zwischen den Querfortsätzen L5–L6 platziert (Abb. 8). Die Faszien- und Hautschnitte wurden kontinuierlich mit 3-0 resorbierbaren Nähten aus synthetischem Glykolid/Lactid-Copolymer verschlossen. Während der Nachbeobachtungszeit traten keine nachteiligen Auswirkungen auf. Versuchstiere wurden 14 oder 27 Wochen nach der Osteogrow-C-Implantation unter Verwendung einer Prämedikation von 3 mg/kg Xylazin und 20 mg/kg Ketamin im und Verabreichung von T61 (1 ml/kg) iv eingeschläfert. Die Lendenwirbelsäule des Kaninchens wurde entnommen, um die in der beschriebenen Analyse durchzuführen folgenden Abschnitten.

Der Erfolg der Wirbelsäulenversteifung wurde vorläufig durch manuelle Palpation festgestellt. Die Wirbelsäulenversteifung galt als erfolgreich, wenn bei manueller Kompression das beobachtete Wirbelsäulensegment (L5–L6) unbeweglich war und keine Bewegung regelmäßig zwischen den Wirbeln beobachtet wurde. Der manuelle Palpationstest wurde von zwei unabhängigen Forschern (NS und NI) durchgeführt.

MicroCT-Analysen wurden verwendet, um den Erfolg der Wirbelsäulenfusion und Osseointegration von neu gebildetem Knochen mit angrenzenden Querfortsätzen zu bewerten und um die Menge an neu gebildetem Knochen und CRM bei Versuchsgruppen zu bestimmen. Am Ende des Experiments wurde die Lendenwirbelsäule aller Tiere wie beschrieben mit 1076 SkyScan MicroCT (Bruker, Belgien) gescannt37,60. Kurz gesagt, die Scanauflösung wurde auf 18 µm eingestellt, die Bildmittelung wurde auf einen Wert von 2 eingestellt und es wurde ein 0,5-mm-Aluminiumfilter verwendet. Nach der Aufnahme wurden die Bilder mit der NRecon-Software (Bruker, Belgien) rekonstruiert und mit der CTAn-Software (Bruker, Belgien) analysiert.

Alle Proben wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Nach biomechanischen Tests wurden drei oder vier Proben pro Gruppe mit 14 % EDTA in 4 % Formalinlösung (20 Tage) zur histologischen Analyse entkalkt. Nach der Entkalkung wurden die Proben in Paraffin eingebettet, in 6 µm-Schnitte geschnitten und wie beschrieben mit Goldners Trichrom-Färbung gefärbt56. Der Rest der Proben (ein oder zwei pro Gruppe) wurde wie zuvor beschrieben und entkalkt verarbeitet37. Kurz gesagt, die Proben wurden dehydriert und manuell mit Methylsalicylat und Xylolen gereinigt. Die Proben wurden zu gehärteten Acrylharzblöcken (MMA) polymerisiert und 5 µm-Mikrotomschnitte wurden mit Wolframkarbidmessern (D-Profil, Delaware Diamond Knives, Delaware, USA) und einem automatischen Schlittenmikrotom (SM2500, Leica Biosystems, Illinois, USA) erstellt. USA). Schließlich wurden die Schnitte auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aus Glas montiert, weichgemacht, hydratisiert und mit der Trichromfärbung von Von Kossa und Goldner gefärbt.

Histomorphometrische Analysen wurden durchgeführt, um die Architektur neu gebildeten Knochens zu analysieren und die von Knochen, Knochenmark und Keramikpartikeln eingenommene Fläche zu bestimmen. Der interessierende Bereich für histomorphometrische Analysen war der neu gebildete Knochen zwischen den Querfortsätzen. Bei der Analyse haben wir neu gebildeten Knochen, der an Querfortsätze angrenzt bzw. diesen überlagert, ausgeschlossen, da es schwierig war, zwischen neuem und nativem Knochen zu unterscheiden. Quantitative Analysen wurden an von Goldner gefärbten histologischen Schnitten durchgeführt und die Bilder wurden mit einem aufrechten Olympus BX53-Mikroskop aufgenommen, das mit einer DP27-Kamera (5 Megapixel, 15 fps) ausgestattet war und mit der Software cellSens Dimension (Olympus, Japan) betrieben wurde. Die Photoshop-Software (Adobe Systems, Kalifornien, USA) wurde verwendet, um interessierende Bereiche (Knochen- und Keramikpartikel) auszuwählen und mit der charakteristischen Farbe zu maskieren, und die Fiji ImageJ-Software (NIH, Maryland, USA) wurde verwendet, um die maskierten Bereiche zu messen bereits beschrieben37,56. Die Ergebnisse wurden als Flächenprozentsatz ausgedrückt.

Biomechanische Parameter (maximale Kraft, Elastizität und Brucharbeit) von neu gebildetem Knochen, der in benachbarte Querfortsätze integriert ist, wurden durch einen Dreipunkt-Biegetest mit dem TA.HDplus-Instrument (Stable Micro Systems, UK) bestimmt. Die Fusionsmasse wurde auf zwei Stützen platziert und die Kraft wurde wie zuvor beschrieben senkrecht zum Mittelpunkt ausgeübt37.

Mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test wurde getestet, ob die Daten einer Gaußschen oder einer nicht-Gaußschen Verteilung folgen. Gaußverteilte Daten wurden mithilfe eines ungepaarten t-Tests (zwei Versuchsgruppen) oder einer gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstests (drei oder mehr Versuchsgruppen) analysiert. Nicht-Gauß-verteilte Daten wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test (zwei Versuchsgruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest (drei oder mehr Versuchsgruppen) analysiert. Die Daten werden als Mittelwert mit Standardabweichung (SD) oder als Median mit einem Bereich von Minimal- und Maximalwerten angezeigt. Signifikante P-Werte (P < 0,05) sind mit Sternchen gekennzeichnet; *(P ≤ 0,05), **(P ≤ 0,01), ***(P ≤ 0,001). Bei allen statistischen Analysen wurde die Statistiksoftware GraphPad Prism (v.8.4.3) verwendet.

Rohdaten wurden im Labor für mineralisierte Gewebe generiert. Abgeleitete Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor, SV, erhältlich.

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Dieses Programm wurde vom FP7-Gesundheitsprogramm (FP7/2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung HEALTH-F4-2011-279239 (Osteogrow), H2020 Health GA 779340 (OSTEOproSPINE) und dem European Regional Development Fund-Scientific Centre of Excellence for Reproductive finanziert und Regenerative Medizin (Projekt „Reproduktive und regenerative Medizin – Erforschung neuer Plattformen und Potenziale“, GA KK.01.1.1.01.0008, gefördert von der EU über den EFRE).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nikola Stokovic und Natalia Ivanjko.

Labor für mineralisierte Gewebe, Zentrum für translationale und klinische Forschung, Medizinische Fakultät, Universität Zagreb, Salata 11, 10000, Zagreb, Kroatien

Nikola Stokovic, Natalia Ivanjko, Igor Erjavec, Marina Milesevic und Slobodan Vukicevic

Wissenschaftliches Kompetenzzentrum für Reproduktions- und Regenerative Medizin, Zagreb, Kroatien

Nikola Stokovic, Natalia Ivanjko, Igor Erjavec, Marina Milesevic und Slobodan Vukicevic

Kliniken für Chirurgie, Orthopädie und Augenheilkunde, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Zagreb, Zagreb, Kroatien

Marko Pecin, Ana Smajlović & Drazen Maticic

Fakultät für Lebensmitteltechnologie und Biotechnologie, Universität Zagreb, Zagreb, Kroatien

Sven Karlovic

Abteilung für Radiologie, Ultraschalldiagnostik und Physiotherapie, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Zagreb, Zagreb, Kroatien

Hrvoje Capak und Zoran Vrbanac

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NS: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung, Projektverwaltung; NI: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung, Datenkuratierung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung; MP: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; IE: Methodik, Datenkuration, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; AS: Recherche, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; MM: Untersuchung, Datenkuratierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; SK: Untersuchung, Datenkuratierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; HC: Untersuchung, Datenkuratierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; ZV: Recherche, Datenkuration, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; DM: Methodik, Validierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision, Projektverwaltung; SV: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung, Ressourcen, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Visualisierung, Projektverwaltung, Finanzierungseinwerbung.

Korrespondenz mit Slobodan Vukicevic.

SV ist Gründer von Genera Research und Koordinator des EU-Stipendiums HORIZON 2020 OSTEOproSPINE zur Finanzierung klinischer Studien des neuen Medikaments zur Knochenreparatur (Patent WO2019076484A1). Die anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stokovic, N., Ivanjko, N., Pecin, M. et al. Langfristige posterolaterale Wirbelsäulenfusion bei Kaninchen, induziert durch rhBMP6, angewendet in autologem Blutkoagulum mit synthetischer Keramik. Sci Rep 12, 11649 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14931-2

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Eingegangen: 11. März 2022

Angenommen: 15. Juni 2022

Veröffentlicht: 08. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14931-2

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